DIVERSIDADE DE ANFÍBIOS ANUROS

DO ESTADO DE SÃO PAULO

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Estudos Citogenéticos em Anuros Brasileiros (Amphibia)

Sanae Kasahara (Depto. Biologia, UNESP/Rio Claro)

Objetivo e Justificativa

Entre os vertebrados, os anfíbios constituem um grupo bastante diversificado em número de espécies,tendo ampla distribuição no mundo e ocorrência em todo o território brasileiro.

No Brasil, os primeiros trabalhos sobre citogenética de anuros surgiram nas décadas de 60 e 70. A grande maioria deles limitou-se à descrição do cariótipo das espécies, com o emprego apenas de técnicas convencionais de coloração, mas mesmo assim com relatos ocasionais de variação cromossômica. O advento das técnicas de bandamento e de marcação cromossômica, que ocorreu a partir da década de 70, representou um grande avanço para a citogenética, já que observações mais detalhadas sobre os cromossomos puderam ser realizadas. Isso contribuiu, sem dúvida, para uma melhor compreensão dos mecanismos que produzem variabilidade cromossômica, tornando mais efetivos os estudos comparativos para o estabelecimento das relações filogenéticas dentro de certos grupos.

Apesar das vantagens da utilização das técnicas de bandamento e de marcação cromossômica, pode-se dizer que estas têm sido pouco empregadas nos anuros da fauna brasileira. Isso é decorrente, em parte, da qualidade bastante pobre das preparações citológicas que, em geral, têm sido obtidas através de métodos, predominantemente, de tipo direto, incluindo o esmagamento de tecidos (squash).

Iniciamos, então, em 1989, os estudos citogenéticos de espécies de anfíbios anuros brasileiros, tendo entre outras finalidades a de melhorar a qualidade das preparações cromossômicas com a implantação de novas metodologias, como a cultura de linfócitos, que permitisse a aplicação de técnicas mais sofisticadas de marcação cromossômica. De fato, com a padronização dessa metodologia em nosso laboratório, a técnica de incorporação de 5-bromodeoxiuridina (BrdU), para obtenção de bandas de replicação, está sendo aplicada com resultados bastante promissores.

O objetivo do projeto é o de caracterizar os cromossomos de espécies de anfíbios anuros da fauna do Estado de São Paulo:

• Com técnicas citogenéticas usuais de marcação de regiões de heterocromatina constitutiva (bandas C) e de identificação de regiões organizadoras de nucléolos pelo nitrato de prata (Ag-RONs).

• Adicionalmente, serão empregadas técnicas de citogenética molecular.

• Com tratamento de células vivas com o análogo de base  BrdU, o qual promove a diferenciação longitudinal dos cromossomos devido a sua incorporação na molécula de DNA. Como cada par tem o seu padrão de replicação particular, há possibilidade de comparação mais efetiva dos cariótipos de diferentes espécies.

• Com emprego de fluorocromos base-específicos, principalmente, a cromomicina A3 (CMA3), mitramicina (MM) e o 4’-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), junto com o contra-corante distamicina A (DA). Este procedimento é, especialmente, útil para a identificação e localização nos cromossomos de tipos particulares de regiões heterocromáticas que apresentam riqueza de bases GC ou AT. Levando-se em conta que os anfíbios anuros se caracterizam por apresentar  padrões cariotípicos altamente conservativos, principalmente quando se usa coloração convencional, a diferenciação das regiões de heterocromatina é interessante para a comparação de espécies ou populações distintas da mesma espécie.

• Com o emprego da técnica de hibridação in situ fluorescente (FISH), principalmente, com sondas de DNAr 18S + 28S, úteis para identificar e localizar as RONs independentemente de atividade transcricional prévia. Embora os anfíbios anuros tenham, em geral, apenas um par de RONs, não é rara a ocorrência de RONs múltiplas ativas ou, eventualmente, silenciosas ou inativas. Os diferentes padrões de distribuição de regiões de DNAr analisados em conjunto com os dados de Ag-RONs são importantes para a comparação citogenética entre espécies ou populações distintas da mesma espécie, mas também para o entendimento da estrutura, organização, funcionamento e regulação dos genes ribossomais não só em anfíbios como nos vertebrados em geral.

Finalmente, uma outra abordagem que está prevista no decorrer do projeto sobre citogenética de anfíbios anuros é, na medida que se fizer necessária, a realização do seqüenciamento de genes para uma comparação mais efetiva entre as espécies. Por exemplo, o seqüenciamento de genes mitocondriais tem sido particularmente interessante para o estabelecimento das relações filogenéticas das espécies de determinados grupos e, principalmente, para a caracterização das espécies crípticas que, além de similaridade morfológica, mostrem-se indistinguíveis do ponto de vista  citogenético.