Caenorhabditis elegans como modelo para
diferenciação celular e morte celular programada
Ana Paula Zampieri Silva
1. Introdução
Nos últimos anos descobriu-se que as células não morrem somente em consequências de doenças, mas são levadas à morte durante o curso normal do desenvolvimento e da homeostasia. A doença pode resultar em uma morte celular em um momento desapropriado, ao contrário se as células não morrem em um dado momento, o resultado é aparecimento do câncer.
Baseando-se nas mudanças que ocorrem nas células quando as mesmas morrem, são propostos dois tipos de morte celular. Um chamado apoptose é caracterizada pela diminuição e fragmentação do citoplasma, compactação da cromatina e eventual destruição de organelas celulares. O segundo tipo é a necrose, a qual difere da apoptose por vários aspectos. A necrose celular parece não fazer parte do desenvolvimento normal ou homeostasia. Este tipo de morte é consequência de uma injúria celular ou uma resposta a mudanças extremas das condições fisiológicas. A morte por necrose é caracterizada por um inchaço da célula.
Estudos genéticos no nemátodo Caenorhabditis elegans tem revelado uma variedade de mutações que em determinados genes exercem efeitos específicos no processo de morte celular programada. As análises dos genes que sofrem estas mutações revelaram que a morte celular programada é um processo ativo que requer uma função genética das células que morrem. Os genes envolvidos neste processo podem não somente causar a morte da célula como também protegê-la da morte. Os dados moleculares e bioquímicos parecem coincidir com os resultados obtidos a partir dos estudos genéticos em C. elegans os quais revelam que o produto protéico de certas células que morreram interage diretamente com os genes envolvidos na morte celular. Todo o processo de regulação gênica da morte celular programada parece ser conservativo para diferentes organismos inclusive no homem. Deste modo os estudos em C. elegans são fundamentais para o entendimento da morte celular programada não somente para este nemátodo, mas para nós mesmos. Entretando existem algumas lacunas no que diz respeito à morte celular programada, como por exemplo: Como a célula "decide" morrer? Como a morte celular é iniciada?
A seguir abordaremos alguns aspectos do processo de diferenciação e morte celular programada em um dos organismos mais estudados da biologia, o nemátodo Caenorhabditis elegans.
2. O que é o Caenorhabditis elegans?
Caenorhabditis elegans é um componente da família Rhabditidae, um grande e diversificado grupo de nemátodes encontrados em habitat terrestre. Alguns são patogênicos ou parasitam animais. A posição filogenética deste organismo ainda não está bem definida.
É um organismo anatômica e geneticamente simples. Quando adulto, C. elegans tem cerca de 1 mm de comprimento e consiste de cerca de 1.000 células somáticas e de 1.000 a 2.000 células germinativas. São geralmente hermafroditas produzem primeiramente células germinativas as quais se diferenciam em espermatozóides (cerca de 250) e depois produzem ovos. A fertilidade é determinada pela quantidade de espermatozóides. A anatomia de C. elegans foi reconstruída célula por célula a partir de cortes por secções seriadas e analisados em Microscopia Eletrônica. O plano do corpo deste verme simples é o mesmo do da maioria dos animais superiores, pelo fato de ter um corpo de simetria aproximadamente bilateral alongado, composto pelos mesmos tecidos e órgãos básicos (nervos, músculos, intestino e tegumento) organizados de uma mesma maneira básica (boca e cérebro na região anterior, ânus na posterior). A superfície externa do corpo é composta por duas camadas: a hipoderme protetora, ou "pele", e a camada muscular subjacente.
Um tubo, localizado entre o intestino e a superfície do corpo, constitui a gônada, sua parede é composta de células somáticas, com as células germinativas dentro dela. Caenorhabditis elegans tem dois sexos: macho e hermafrodita. O hermafrodita pode ser considerado como uma fêmea que produz um número limitado de espermatozóides: este organismo pode reproduzir-se ou por autofertilização, utilizando o seu próprio esperma, ou por fertilização cruzada após transferência de esperma masculino pelo acasalamento. O primeiro processo permite que um simples verme heterozigoto produza progênie homozigota, fazendo com que C. elegans seja um organismo conveniente para estudos genéticos. O ciclo de vida do animal consiste de um período de desenvolvimento embrionário dentro da casca do ovo, quatro estágios larvais e finalmente o adulto. O nemátodo é facilmente cultivado em laboratório e tem um tempo de vida curto, atingindo a maturidade com 2,5 dias a 25º C.
O animal tem seis pares de cromossomos (cinco autossomos e um sexual). O genoma haplóide tem 108 pares de nucleotídeos de DNA, vinte vezes maior que Escherichia coli, e trinta vezes menor que humano. A vida deste organismo inicia-se como uma única célula, que dá origem, através de divisões celulares repetidas, as 558 células que formam o pequeno verme dentro da casca do ovo. Após eclodir, divisões posteriores resultam no crescimento e na maturação sexual do verme. Após a muda final, a qual o transforma em animal adulto, o verme hermafrodita começa a produzir os seus próprios ovos.
Cerca de 97 milhões de pares de bases foram sequenciados tornando-o um organismo modelo para estudos sobre o câncer, mal de Alzheimer, distrofia muscular, envelhecimento e muitos outros aspectos. Além disso, C. elegans é pequeno e transparente, suas células podem ser acompanhadas individualmente, à medida que elas se dividem, migram, diferenciam-se e morrem no embrião vivo, e suas genealogias podem ser traçadas desde o ovo até o organismo adulto. O mecanismo de morte celular programada em C. elegans segue um padrão completamente previsível e possível de ser comparado ao de outros organismos por ser um mecanismo altamente conservativo.
3. Caenorhabdites elegans como modelo para estudos da diferenciação e morte celular programada
Caenorhabdites elegans é um modelo para estudos da diferenciação e morte celular programada normal e aberrante tanto do ponto de vista genético quanto molecular.
Como mencionado acima, C. elegans é um animal transparente durante todo o seu ciclo de vida e o núcleo das células pode ser facilmente visualizado. Estes atributos possibilitam a identificação da sequência completa de divisões somáticas, desde o ovo fertilizado até o adulto hermafrodita com 959 células. O mapeamento genético revelou que certas células morrem em tempos específicos. O conhecimento detalhado do desenvolvimento normal facilita a identificação de mutantes com padrões aberrantes de morte celular. Das cerca de 1.000 células, 131 são destinadas à morte. O padrão de morte celular observado e a identidade das células afetadas é invariável. A maioria das células morre na fase embrionária, durante a qual 113 das 131 células geradas neste período morrem.
Inúmeros trabalhos relativos à diferenciação ou morte celular programada, bem como estudos sobre câncer e doenças degenerativas foram realizados utilizando como modelos o nemátodo C. elegans. Dentre estes trabalhos destaca-se o de Reis e Ebert (1996) os quais realizaram estudos em três organismos C. elegans, Mus musculus e Drosophila melanogaster para a identificação de genes responsáveis pela longevidade nessas espécies distantes filogeneticamente, mas com processo de envelhecimento muito conservado. Outro trabalho cujo objetivo era a identificação do gene "piwi" responsável pela renovação de células tronco, foi relatado também em C. elegans por Cox et al. (1998). Chen et al. (1992) identificou determinados genes responsáveis pela diferenciação da camada muscular de C. elegans.
Em se tratando deste nematóide como modelo para o estudo de diferenciação celular, destaca-se o relato de Strome e Wood (1983) apud Gilbert (1991) que descobriram que durante a migração do pronúcleo no zigoto, os grânulos P (encontrados no citoplasma deste organismo), antes distribuídos ao acaso, ficavam localizados na extremidade posterior do zigoto, de maneira que estes grânulos somente se incorporavam no blatômero posterior (P1) à medida que os pronúcleos se aproximavam. Na mitose seguinte, os grânulos situavam-se no blastômero posterior (P2), e finalmente fixavam-se na célula P4, cuja progênie se transforma nos espermatozóides e óvulos no adulto. Os determinantes da linhagem intestinal no início também se posicionam no blastômero P1 que, posteriormente, dará origem à célula precursora do intestino.
Outra interação celular no desenvolvimento de C. elegans ocorre entre uma célula que se encontra na gônada, denominada célula âncora, e células hipodérmicas que originarão a vulva, através da qual os ovos serão postos. Quando a célula âncora é destruída, as células hipodérmicas não se dividem para formar a vulva. Entretanto, se a célula âncora estiver próxima da hipoderme, a vulva se formará. Isto mostra que esta célula induz a formação da vulva. As seis células precursoras da vulva, influenciadas pela célula âncora, formam um grupo de equivalência. Durante o desenvolvimento normal, as três células centrais dividem-se para formar a vulva, enquanto as outras três periféricas, se dividem para formar seis células hipodérmicas. Se a célula âncora é destruída, todas as seis células do grupo de equivalência dividem-se, originando doze células hipodérmicas. Se as três células centrais forem destruídas, as três periféricas, que normalmente foram células hipodérmicas, originarão células da vulva.
4. Regulação dos genes envolvidos na morte celular programada em C. elegans
A eliminação de células pela morte celular programada é importante no desenvolvimento e um processo homeostático nos organismos multicelulares, incluindo C. elegans. Os genes envolvidos na morte celular programada em C. elegans são comparáveis a genes semelhantes que controlam a morte em outros organismos, incluindo mamíferos.
Os genes egl-1, ced-4, ced-3 e ced-9 são os reguladores globais desencadeando a morte celular programada em C. elegans.
Três genes de C. elegans egl-1, ced-4 e ced-3 parecem ter uma função essencial na morte celular programada em células somáticas. Mutações nesses três genes levam à sobrevivência de células programadas para morrer durante o desenvolvimento. O gene egl-1 foi caracterizado originalmente por mutações de "ganho-de-função" que causa um defeito dominante na postura dos ovos atribuído à perdas de neurônios HSN funcionais nos hermafroditas, este defeito é causado pela morte celular programada desses neurônios.
A atividade do gene ced-9, protetor na maioria das vezes, atua contra a ação da morte celular programada durante o desenvolvimento de C. elegans. Mutações com perda de função em ced-9 causam esterilidade e letalidade maternal como consequência da ativação ectópica da morte celular programada em células normais. O gene ced-9 foi caracterizado originalmente como um alelo que bloqueia a morte celular programada.
A caracterização dos genes envolvidos na morte celular programada em C. elegans foi a chave para revelar alguns mecanismos bioquímicos da morte celular programada em todos os animais. A descoberta do gene ced-3, um componente das caspases (protease cisteína-aspartato específica) família de proteases atuantes na morte celular, foi fundamental para a identificação da ação das caspases nos mamíferos na regulação da morte celular programada. Uma proteína relacionada ao gene ced-4, APAF-1 parece estar envolvida no processo da morte celular programada nos mamíferos, ambas proteínas necessitam ligar-se a um nucleotídeo para seu funcionamento. A clonagem do gene ced-9 revelou que o produto proteico é semelhante à proteína BCL-2 nos mamíferos, a qual a partir de experimentos com cultura de células mostrou estar intimamente relacionada à morte celular programada nestes animais. Foi a partir desses estudos comparativos sobre genes que atuam na morte celular programada em C. elegans e em humanos, que surgiram fortes evidências que o mecanismo da morte celular programada é um processo evolutivamente conservado. Os estudos genéticos sugerem que os genes egl-1, ced-4 e ced-3 funcionam exclusivamente na morte celular programada, que não é essencial para a viabilidade de C. elegans. Animais homozigotos para a mutação de perda de função nesses genes são normais no tamanho e movimento.
Os experimentos genéticos evidenciaram funções específicas para os genes egl-1, ced-9, ced-4 e ced-3. Como relatado acima, uma mutação da perda de função no gene ced-9 leva à letalidade devido a uma ativação de morte celular programada ectópica. Essas mortes são suprimidas pela mutação da perda de função por ced-4 ou ced-3, indicando que ced-9 funciona normalmente para regular negativamente ced-4 e ced-3. O produto do gene ced-9 pode inibir bioquimicamente ainda mais a expressão ou ativação de ced-4 e ced-3. Ao contrário, a perda de função de egl-1 o qual evita a morte celular programada das células somáticas não suprime a letalidade resultando na perda de função de ced-9. Os resultados indicam que egl-1 atua geneticamente acima e funciona como um regulador negativo de ced-9.
A mutação de perda de função em ced-4 ou ced-3 suprime a letalidade causada pela perda de função de ced-9. Ao contrário, a mutação de perda de função em egl-1 não suprime ced-9 (letalidade).
A "super-expressão" de ced-3 ou ced-4 pode matar células de C. elegans. Na ausência de ced-4, o gene ced-3 "super-expressado" pode matar com menor eficiência. Ao contrário, na ausência de ced-3, ced-4 é incapaz de matar células. Esses resultados indicam que ced-4 atua acima de ced-3 na morte celular programada.
A atividade endógena de ced-9 protege a célula da morte celular programada pela "super-expressão" de ced-3, causando maior mortalidade e causando mais eficiência do que a mutação em ced-9.
A "super-expressão" do gene egl-1 pode matar células de C. elegans.
Os dados indicam que ced-3 necessita de ced-4 para induzir a morte mas que ced-4 não necessita de ced-3 para induzir a morte. A "super-expressão" de ced-9 atua como inibidor da função de ced-4. Na ausência de atividade de ced-4, o gene ced-9 falha em proteger da morte quando ced-3 é "super-expressado". Uma "super-expressão" de egl-1 pode matar células que normalmente sobrevivem. A morte depende de ced-4 e ced-3 colocando egl-1 acima desses genes. Uma "super-expressão" em ced-9 pode bloquear a morte celular programada e o gene ced-4 pode funcionar como ativador ou inibidor da morte.
Na espécie humana existe uma interação entre as células programadas para morrer. Entretanto no organismo C. elegans, pouca interação ocorre entre elas, muitas células são provavelmente autônomas. Deste modo, como a morte de uma célula autônoma é iniciada? Existem duas sugestões: a morte celular é desencadeada por algum defeito celular, ou seja algum problema no processo de diferenciação; ou ocorre como consequência normal do processo de diferenciação. O desencadeamento da morte celular programada é provavelmente a partir de um controle transcripcional. A análises genéticas identificaram dois genes, ces-1 e ces-2 que são responsáveis por este controle.
A análise genética da morte celular programada em C. elegans identificou mutações que afetam quatro aspectos do processo de morte: 1. regulação da ativação da morte celular; 2. execução da morte celular; 3. fagocitose das células mortas; 4. degradação do DNA das células mortas. Nenhuma célula que sobrevive devido à mutações nos genes ced-3 e ced-4 deixa de se dividir, sugerindo que a morte celular programada não serve para eliminar a proliferação celular. Todas as células sobreviventes são aparentemente normais na morfologia, locomoção e fertilidade. Entretanto uma análise mais detalhada revela algumas diferenças como o desenvolvimento mais lento do organismo, isto indica que a morte celular programada parece melhorar o desempenho do animal.
Genes responsáveis pela fagocitose das células mortas
Mutações em seis genes (ced-1, ced-2, ced-5, ced-6, ced-7, ced-10) previnem a fagocitose das células que morreram. Na ausência do engolfamento, a célula morta adota uma aparência refratária e permanece neste estágio por horas. As mutações nos genes ced não bloqueiam completamente a fagocitose.
Uma nuclease é responsável pela degradação do DNA
Com o gene nuc-1, a morte celular e a fagocitose procegue normalmente, entretanto, o DNA dessas células mortas permanece como uma massa compacta quando o material é corado pelo método de Feulgen. Estudos bioquímicos indicam que nuc-1 controla a atividade de Ca2+, Mg2+ independentemente da desoxirribonuclease. Esta enzima auxilia na degradação do DNA nuclear.
O processo de degradação do DNA na morte celular programada em C. elegans difere do observado nos vertebrados (apoptose) por dois aspectos: 1. nucleases timocíticas podem induzir a apoptose nos vertebrados. O papel da nuc-1 em C. elegans é eficiente para limpar os resíduos celulares e não matar a célula propriamente dito. É possível que outros genes que codificam outras atividades da endonuclease participe das primeiras fases da morte celular programada em C. elegans. 2. as propriedades bioquímicas das nucleases envolvidas na morte celular programada de C. elegans e de mamíferos são diferentes.
Regulação da morte celular programada
Estudos genéticos indicam que existem determinados genes que atuam em um grupo selecionado de células e outros genes que funcionam globalmente. Os genes ces-1 e ces-2 codificam fatores celulares específicos que regulam a morte de algumas células no desenvolvimento da faringe.
V. Morfologia das células que morreram
As mudanças morfológicas que ocorrem nas células que morrem têm sido documentadas com o auxílio da Microscopia de Luz e Eletrônica. Através da Microscopia Eletrônica, estudos nas células de C. elegans que morreram apresentam a morfologia semelhante a dos outros animais. Estes estudos dividem o processo de morte em cinco diferentes estágios; entretanto as mudanças morfológicas observadas são contínuas e progressivas.
O destino das células fadadas a morrer pode ser observado após a divisão celular. A célula destinada a morrer é geralmente menor que a sua célula irmã e esta é rodeada em parte por um prolongamento citoplasmático que se extende para a célula vizinha. Durante este primeiro "estágio" da morte celular, o núcleo e o citoplasma não diferem das células irmãs.
Um exemplo da morte celular relacionada ao processo de diferenciação celular é o que ocorre com a célula irmã viável (que não vai morrer) como P11.aap ou P11. aaap a qual tornar-se-à um neurônio motor, diferenciando-se, iniciando a expansão do axônio. Na célula que vai morrer esta diferenciação não ocorre.
No próximo "estágio" é bem evidente qual é a célula destinada a morrer e a fagocitose pelas células vizinhas inicia-se. A nível ultra-estrutural, o citoplasma torna-se condensado e o envelope nuclear dilata-se. No núcleo, a cromatina agrega-se e partículas elétron-densas se formam. Porções da célula são deslocadas na periferia das membranas a partir da fagocitose das células vizinhas. No "estágio" subsequente a célula morre e a fagocitose continua. A membrana nuclear desagrega-se, dispersando a cromatina no citoplasma. Fendas na membrana e material elétron-denso pode ser detectado dentro dos vacúolos de células vizinhas da hipoderme, os quais engulfam todo o resto da célula morta.
O tempo gasto para a ocorrência da morte celular é muito curto, cerca de uma hora. As mudanças morfológicas associadas com a morte celular programada em C. elegans são comumente observadas na apoptose dos vertebrados e invertebrados. As mudanças mais comuns são: condensação do citoplasma, agregação da cromatina nuclear, fragmentação das células e fagocitose por células vizinhas. A similaridade da morte celular programada em organismos divergentes sugere um mecanismo conservado na remoção dessas células.
6. Importância da morte celular programada
O estudo de células em meio de cultura mostra que cada célula tem um tempo de vida limitado com capacidade para dividir-se um número específico de vezes. Estas observações sugerem que a longevidade da célula é geneticamente determinada. Alelos mutantes do gene age-1 podem aumentar o tempo de vida do nemátodo em 60%, de uma maneira que aumenta o tempo de vida. Analisando-se o gene mutante age-1 observou-se que C. elegans tem elevados níveis de catalase e Cu/Zn quando mais velho, reforçando a idéia de que o aumento da tolerância ao "stress" oxidativo está correlacionado com o tempo de vida do animal. Também nesta mesma espécie, o aumento da produção de espermatozóides implica no encurtamento do tempo de vida do macho.
Em determinadas situações, podem ocorrer mutações nos genes os quais alteram o ciclo de vida. Na ausência de alimento, C. elegans inicia um terceiro "estágio" larval alternativo denominado "dauer larva". Essas larvas se movimentam, não comem e podem sobreviver por mais de 60 dias. Na presença de alimento, as "dauer larva" diferenciam-se dando início ao quarto "estágio" larval tornando-se um indivíduo adulto fértil. O tempo de vida dos animais que passaram por este estágio especial é o mesmo daqueles que não passaram. Mutações em daf-2 causa nos hermafroditas maior longevidade (200%) e o daf-16 elimina esta extensão de vida promovida pelo daf-2.
7. Morte celular patológica em C. elegans
A morte celular patológica pode ocorrer como uma consequência da desregulação da morte celular programada. Uma ativação inapropriada da morte celular programada em células destinadas a sobreviver pode tanto afetar apenas um grupo de células como interferir na sobrevivência do organismo.
A morte pode ser causada por uma fagocitose inapropriada devido à mutações nos genes lin-24 e lin-33 que provocam alteração da morfologia das células e as mesmas começam a fagocitar células vizinhas.
Uma mutação rara nos genes mec-4 e deg-1 causa edema e degeneração de neurônio específico do animal. O produto gênico desses genes podem até matar a célula por mecanismos que diferem da morte celular programada. Os genes mec-4 e deg-1 são membros da família das digerinas as quais induzem o processo de degeneração celular.
Na espécie humana, desequilíbrio no processo de morte celular gera inúmeras doenças degenerativas, incluindo Alzheimer.
8. Conclusões
A partir da leitura do presente trabalho, cujo tema é "Caenorhabiditis elegans como modelo para diferenciação celular e morte celular programada" pode-se concluir que:
1. C. elegans é um organismo anatômica e geneticamente simples e transparente durante o seu ciclo de vida. Cerca de 97 milhões de pares de bases foram sequenciados tornando-se um organismo modelo para estudos sobre câncer, mal de Alzheimer, distrofia muscular, envelhecimento e muitos outros aspectos.
2. A partir de estudos em C. elegans descobriu-se que mutações em determinados genes podem desencadear o processo de morte celular programada.
3. O mecanismo de morte celular programada em C. elegans sugere um padrão completamente previsível de ser comparado ao de outros organismos por ser um mecanismo altamente conservativo.
4. A análise genética da morte celular programada em C. elegans identificou mutações que afetam quatro aspectos do morte celular programada: a. regulação da atuação da morte celular; b. execução da morte celular; c. fagocitose das células mortas, d. degradação do DNA das células mortas.
5. A microscopia de Luz e Eletrônica têm possibilitado a identificação de mudanças morfológicas que ocorrem nas células que morrem.
6. A morte celular patológica pode ocorrer como uma consequência da desregulação da morte celular programada.
VIII. Bibliografia consultada
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Chen, L.; Krause, M.; Draper, B.; Weintraud, H.; Fire, A. Body-wall muscle formation in Caenorhabditis elegans embryos that lack the MyoD homolog hlh-1. Science, 256:240-242. 1992.
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Metzstein, M. M.; Stanfield, G. M.; Horvitz, H. R. Genetics of programmed cell death in C. elegans: past, present and future. Reviews, 14:410-416. 1998.
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